庄广伦:辅助生育技术的新进展
发布时间:2017-08-17 浏览数量:

庄广伦:辅助生育技术的新进展

  试管婴儿的问世,为人类生殖自我调控树立了新的里程碑。20 多年来,辅助生育技术不断发展。80 年代,试管婴儿技术主要为解决女性不孕症,以Edwards 和Steptoe 首创的体外受精( IVF) 与胚胎移植( ET) 为常规试管婴儿技术。1992年,Palermo 首先使用单精子卵胞浆注射( intracytoplasmic sperm injection ,ICSI) 治疗少弱精不育,技术难度更高,被称为男性不育治疗的里程碑。随着近年来分子生物学技术的进步,使单细胞水平进行人类基因诊断成为可能。

  在辅助生育的显微操作基础上结合现代分子生物学,发展为人类胚胎植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis ,PGD) 的优生辅助生育技术。随着核移植技术不断发展,利用核移植技术进行配子重构,不久的将来有可能成为人类生殖医学应用的新突破。

  至少,在现阶段人们可通过改进超排卵方案、提高卵子质量、发展实验室培养系统、开拓分子生物学技术等方面,来达到提高辅助生育技术的妊娠率,降低多胎率,减少并发症,出生健康婴儿的目的。

  一、超排卵方案面临的挑战

  90 年代初期,常规使用促性腺激素释放激素激动剂(GnRH2a) 联合促性腺激素( Gn) 超排卵,对早发黄体生成素(LH) 峰起到了良好的抑制作用,可避免过早黄素化,改善卵泡的同步发育,提高卵子质量。但是GnRH2a 并不能阻止卵巢过度刺激综合征(OHSS) 的发生。由于卵泡期高LH 水平对卵子有不良影响,90 年代后半期超排卵药物趋向于应用高纯度促卵泡激素(FSH) (HP2FSH ,LH 含量< 011 ) 及基因重组FSH (rec2FSH ,不含LH) 。

  高纯度意味着有较低有害物质和具有较高的生物活性。有研究表明,使用rec2FSH 的超排卵效率和安全性与绝经期促性腺激素(hMG) 、FSH、HP2FSH之间无显著性差异。近来有学者提出,要区分过多LH 产生的副作用与适量LH 产生的生理作用。LH 半衰期远较FSH短,注射hMG不会导致LH 升高。适量的LH 可使成熟卵子数、移植胚胎数明显升高,而生化妊娠及早期流产率明显降低。

  故超排卵中,对正常内分泌功能的患者过度降低LH 水平,可能产生不良的结局[1 ] 。新一代的GnRH 拮抗剂,可竞争性结合垂体的GnRH 受体,效应产生迅速,其去垂体效应及安全性与激动剂无差别。其应用方案有单剂量和多次用药两种。临床研究表明,与激动剂相比,其使用Gn 时间、剂量、获卵数、成熟卵子数、胚胎数要少。一旦停药,垂体功能迅速恢复,不需要黄体支持。适用于对Gn 过度反应和正常反应者,可减少OHSS 的发生,但不适用于Gn 低反应者[2 ] 。

  二、ICSI 是否取代常规IVF

  ICSI 起初应用于严重男性不育,由于ICSI 种植率比常规IVF 高,其应用范围逐渐扩大,包括既往常规IVF 受精失败、不明原因不育,甚至用于年龄大于38 岁的妇女。但Bhatta2 charya 等[3 ]近期报道,ICSI 对非男性因素的治疗没有优越性。一些前瞻性研究显示,对中等程度畸形精子仍然以常规IVF为主选[4 ] 。

  对常规IVF 失败再次ICSI (late ICSI) 授精治疗的妊娠率几乎为零,其原因在于卵子老化或与种植窗不同步。目前,大多数生殖中心已放弃使用。

  1995 年Fishel 初次报道圆形精细胞卵浆内注射(ROSI)授精获得妊娠成功,曾风靡一时,但由于确认圆形精细胞困难,以及未成熟精子受精可能带来的基因缺陷难以估计,热度逐日下降。

  ICSI 的安全性仍然受关注,因为非阻塞性无精症的染色体异常率高,另外,有推测睾丸精子在受精时染色体印迹并未完全结束,虽然可能对受精和胚胎早期发育影响不大,但可能导致出生后的异常。比利时Brussels 组追踪调查了229个经ICSI 和133 个经常规IVF 出生的2 岁幼儿,并未发现ICSI 的幼儿智力发育迟缓,但ICSI 的性染色体非整倍体率和结构异常率有轻微的增高[5 ] 。

  三、PGD 比起初设想的更为复杂

  PGD 作为产前诊断的一种形式,为不愿意接受终止妊娠的遗传病高危夫妇提供了选择手段。PGD 通常是指从获得的卵母细胞取极体或IVF 的胚胎取部分细胞进行检测,将确诊无遗传病的胚胎移植入子宫,从而防止遗传病患儿的妊娠。

  初次PGD 妊娠成功在1990 年,分别由Handyside 和Verlinsky 所在的生殖中心报道,至今已有分布于17 个国家的40 多个生殖中心建立了PGD 技术,大约已进行了2 000个PGD 临床治疗周期,接近500 例妊娠,已有超过400 个健康婴儿出生。PGD 周期的三分之二是在美国进行的,国内中山医科大学生殖中心已进行PGD 18 个周期,7 例妊娠,已分娩4个健康婴儿。

  在过去10 年里,PGD 技术的进展较慢,PGD 比起初设想的更为复杂。荧光原位杂交的应用使人们逐渐发现,在人类的胚胎中存在高比例的染色体嵌合型。因此,单个卵裂球是否能代表整个胚胎已开始令人质疑。由于染色体嵌合型和等位基因脱扣等问题,诊断的准确率难以达到保证。另外,尽管多数PGD 的患者都有生育能力,但PGD 的每个周期出生率与常规IVF 相近,而且PGD 的费用也较高。但对自身不孕和反复流产的患者而言,PGD 仍不失为一值得尝试的方法[6] 。

  四、囊胚培养是辅助生育技术的研究热点

  在辅助生育领域中,受人们关注的是低出生率和高多胎妊娠率。如何在不降低妊娠率的同时减低多胎妊娠率,是辅助生育研究的热点之一。而移植2 个以下的有活力囊胚期胚胎即可解决这一问题。因为囊胚与子宫内膜发育同步,符合种植的生理要求。另外,囊胚跨越了胚胎基因激活的阶段,有利于挑选有活力的胚胎。因此,囊胚的种植率高。

  但在过去的20 年里,由于培养环境的限制,囊胚的形成率和种植潜能较低,因此常规是在胚胎早期卵裂期(第2 天或第3 天) 移植胚胎,以避免不良环境对胚胎的影响。曾有生殖中心使用共同培养方法来获得可接受的囊胚率(4~5成) 。虽然有报道共同培养的囊胚种植率明显提高,但其技术难以普遍开展。

  近年来,序贯培养的方法有取替共同培养的趋势。序贯培养液是根据胚胎不同发育阶段的需求而设计的,如G1 培养液含有与输卵管液浓度相同的碳水化合物以及早期分裂胚胎需要的非必需氨基酸、谷氨酰胺和乙二胺四乙酸,因此适合于8 细胞期以内的胚胎培养。G2 培养液的碳水化合物含量与子宫的含量相同,且同时含有必需和非必需氨基酸,而没有影响囊胚形成的乙二胺四乙酸。由于序贯培养满足了胚胎的生理需求和营养物质的供应,因此,序贯培养的囊胚更有活力,种植的潜能高。

  1999 年Gardner[7 ]报道,在第3 天有≥3 个8 细胞期胚胎的治疗周期中,用序贯培养法的囊胚种植率为4成,而妊娠率达6.5成。但在反复失败的患者中,囊胚培养似乎应用价值不大。Levitas 等[8 ]在2000 年的欧洲人类生殖与胚胎协会会议上报道了对50 例反复IVF 失败患者进行囊胚培养和第3 天移植的前瞻性随机研究,囊胚的种植率明显提高,达4017,移植1 个囊胚相当于移植3 个培养48~72 h 的胚胎,但每次取卵的妊娠率分别为2215和2212,没有显著性差异。

  五、原核评分评估胚胎发育潜能的价值

  虽通过囊胚培养可以达到减少多胎妊娠的目的,但仅适用于第3 天有一定数量的高质量胚胎的患者,而体外培养时间的延长可能对胚胎也有一定的负面影响,且囊胚的冷冻和复苏还需进一步研究。

  因此,近年来有学者提出可以原核评分来大致评估胚胎的潜能,增加第3 天选择胚胎形态的参数。原核评分的基础是两个原核核仁前体发育的快慢和同步化。1999 年Tesarik等[9 ]将原核分为6 种类型,其中O 型的胚胎发育停滞率为815,种植率为100 ,而其他5 种类型的原核发育停滞率为20~31。在至少有1 个O 型胚胎移植的周期中,妊娠率为50,而没有O 型胚胎移植的周期妊娠率仅为9。

  1998 年Scott 等[10 ]对97 个周期的原核进行原核评分,根据分数的高低选择原核移植, 当原核评分> 15 时,种植率为28,分娩率为65。因此,原核期对胚胎进行质量评估有一定的参考价值。

  六、卵子和卵巢组织冷冻的新突破

  卵子和卵巢组织的冷冻使长期保存生殖细胞和生殖组织成为可能。它不单可以保存IVF 中的剩余卵子,还能为癌症患者在化疗前保留部分生殖细胞或组织供化疗后使用。

  另外,还可用于赠卵的治疗周期。但卵子对低温非常敏感,经冷冻后卵子发生不同程度的细胞破坏,如细胞骨架的紊乱、染色体的异常和纺锤体的不完整。

  1999 年Cha 在美加生殖医学年会上报道,用含高浓度的冷冻保护液和极快速的玻璃化冷冻的人类不成熟卵子解冻后,83的生殖泡核形态正常,68培养后成熟,受精率为68,但移植后无成功妊娠。但用同样方法冷冻的成熟卵子中,77形态正常,51能正常受精,19 个受精胚中有16 个发育至2~8 细胞期,经移植给4 例患者后获得2 例妊娠。

  卵巢组织的冷冻也取得了一定的进展。将复苏的人胎儿卵巢移植到免疫抑制的小鼠体内可发育至次级卵泡和窦卵泡[10 ] 。因此,卵子和卵巢组织的冷冻有一定的应用价值,值得进一步的研究。

  七、核移植技术在辅助生育领域中应用的可能性

  年龄相关的卵子非整倍体增加,是导致高龄不孕妇女胚胎种植率下降的一个重要原因。使用年轻供卵者的卵子获得妊娠率明显提高。虽然卵子赠送能为这部分妇女解决生育问题,但不是完满的结局,因为这些妇女只是孩子的生物学母亲,而不是遗传学意义的母亲。近年来,核移植技术的发展为卵子重建提供了一些新的解决办法。其一是进行生殖泡核移植[11 ] ,即将生殖泡从高龄妇女不成熟卵子中分离出来,并与去除生殖泡的年轻妇女的卵浆进行融合,重建后的卵子再经过体外成熟用ICSI 辅助授精发育成胚胎。

  由于这一过程在生殖泡破裂之前进行,因而对于年龄相关的非整倍体率增高导致的不孕尤其适用[12 ] 。然而,由于高龄妇女获卵较少,实际操作中能够用于生殖泡核移植的卵子并不多,对于卵巢早衰或卵巢反应性低的患者应用价值并不大。

  其二,是近年来随着核移植技术在哺乳动物克隆中的成功应用,已有人考虑用体细胞核移植技术以获得大量重构卵子[12 ] 。其理论依据是生殖泡期小鼠卵浆具有诱导分裂期生殖细胞或已分化体细胞发生类减数分裂形成单倍体的能力[13 ] 。虽然这一做法的过程类似于动物克隆,但由于通过核移植获得的是卵子而不是胚胎,因而从本质上看与克隆又是完全不同的。

  如果这一想法得到实现,则有可能为卵巢功能低下的高龄不孕妇女提供足够的卵子。不过,在将这一技术应用于人类之前还有大量的问题值得探讨。

  首先,哺乳动物体细胞核移植的成功引起人们对克隆人的担心,现在已有许多国家明文规定禁止将核移植技术应用于人类;

  第二,无论采用胚胎细胞或体细胞进行动物克隆,都需要进行核的重排,目前进行哺乳动物体细胞克隆的细胞来源多限于卵丘细胞、乳腺上皮细胞等生殖系统细胞,其他体细胞的核是否也具有被完全重排的能力,尚有待进一步研究;

  第三,近来的研究表明,克隆羊多利(Dolly) 可能存在早衰现象[14 ] ,从体细胞核移植得来的卵子发育成的个体是否也会出现这种情况,尚不得而知;

  第四,哺乳动物克隆过程中胚胎及胎儿死亡率高的问题已引起人们的高度重视[15 ] 。

  因此,虽然核移植技术为辅助生育技术描绘了非常美好的前景,但在这些影响胚胎发育安全性的因素彻底阐明之前,尚不适宜于将其应用于人类。

  八、人类胚胎干细胞的医学应用前景

  胚胎干细胞是从早期发育胚胎中分离的具有高度未分化的细胞,具有在一定条件下向3 个胚层(内、中和外胚层)分化的全能性,易于进行基因操作,因此可以成为联系细胞与个体之间的桥梁。1981 年获得鼠胚的胚胎干细胞,随后获

  得羊、猪的胚胎干细胞,1998 年Wisconsin 大学初次获得了人的传32 代的胚胎干细胞[16 ] 。由于胚胎干细胞所具有的重要的科学价值,1999 年被评为美国十大科技新闻之一,同年美国国家健康研究所解除对人胚胎干细胞研究的禁令,近来英国又解除禁令,在世界上掀起了对人胚胎干细胞研究的热潮。

  人类胚胎干细胞应用于生物技术的科学价值,在于其将改变基因改造的速度和改变物种改造的速度。人类胚胎干细胞的研究具有广阔的应用前景,胚胎干细胞的研究将对人类早期胚胎的发育的认识起重要的作用;胚胎干细胞作为组织工程的种子细胞,将为成千上万的患者提供可移植的器官。

  参考文献

  1.Westergaard LG, Laursen SB , Andersen CY. Increased risk of early pregnancy loss by profound suppression of luteinizing hormone during ovarian stimulation in normogonadotrophic women undergoing assisted reproduction. Hum Reprod ,2000 ,15 : 100321008.

  2.Akagbosu FF. The use of GnRH agonists and antagonists in infertility. In : Brinsden PR , ed. A textbook of in vitro fertilization and assistedreproduction. 2nd ed. London : The Parthenon Publishing Group ,2000. 83290.

  3.Bhattacharya S , Shabban M, Khalaf Y, et al . A randomised controlled trial of IVF and ICSI in non2male factor infertility. Hum Reprod , 2000 , 15 (abstract book 1) :60.

  4.Mortier A , De Sutter P , Pelinck MJ , et al . Prospective controlled randomized study of conventional IVF versus ICSI in the treatment of male factor infertility with moderate teratozoospermia. Hum Reprod , 2000 , 15 (abstract book 1) : 61262.

  5.Bonduelle M, Heurckmans N , De Ketelaere V , et al . Developmentaloutcome of children born after ICSI compared to childrem born after IVF at 2 years old. Hum Reprod , 2000 , 15 (abstract book 1) :63.

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  8 Levitas E , Lunenfeld E , Shoham2Vardi I , et al . Blastocyst stage versus 48272h embryo transfer in women who failed to conceive on three or more IVF treatment cycles : a prospective , randomized study. Hum Reprod ,2000 , 15 (abstract book 1) :829.

  9 Tesarik J , Greco E. The probability of abnormal preimplantation development can be predicted by a single static observation on pronuclear stage morphology. Hum Reprod ,1999 ,14 :131821323.

  10 Scott L ,Smith S. The successful use of pronuclear embryo transfers the day following oocyte retrieval . Hum Reprod ,1998 ,13 :100321013.

  11 Zhang J , Wang CW, Krey L , et al . In vitro maturation of human preovulatory oocytes reconstructed by germinal vesicle transfer. Fertil Sertil , 1999 , 71 :7262731.

  12 Tsai MC , Takeuchi T, Bedford JM, et al . Alternative sources of gamates : reality or science fiction ? Hum Reprod , 2000 ,15 : 9882998.

  13 Kubelka M, Moor RM. The behavior of mitotic nuclei after transplantation to early meiotic ooplast or mitotic cytoplasts. Zygote ,  1997 ,5 : 2192227.

  14 Schiels PG, Kind AJ , Campell KH , et al . Analysis of telomere lengths of cloned sheep. Nature , 1999 ,399 :3162317.

  15 Edwards RG, Beard HK. How identical would cloned children be ? An understanding essential to the ethical debate. Hum Reprod Update ,  1998 ,4 :7912811.

  16 Thomson JA , Itskovitz2Eldor J , Shapiro SS ,et al . Embryonic stem celllines derived from human blastocysts. Science ,1998 ,282 :114521147.

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